Общее введение в L-PRF

Что такое L-PRF?

Заживление ран остаётся чрезвычайно важной темой в стоматологии и других областях медицины как для здоровых пациентов, так и, в ещё большей степени, для пациентов с сопутствующими заболеваниями. Были предприняты бесчисленные попытки найти «биоактивные» добавки, которые способствуют и ускоряют заживление ран, регулируют воспаление и улучшают регенерацию. Концентраты тромбоцитов (PC), получаемые из собственной крови пациентов, достигли этих целей за счёт облегчения рекрутирования, пролиферации и созревания клеток, участвующих в заживлении и регенерации тканей (Boswell и соавт.¹). Их использование во время хирургических вмешательств или в виде инфильтраций в настоящее время является обычной практикой в большинстве областей медицины, особенно в челюстно-лицевой хирургии, а также в ортопедии и спортивной медицине. Протокол подготовки фибрина, богатого лейкоцитами и тромбоцитами (L-PRF), а также протоколы его клинического применения значительно улучшились за последние 20 лет, при этом для большинства процедур доступны рекомендации, основанные на доказательной медицине.

Сгусток или мембрана L-PRF может быть определён как твёрдая форма фибрина или кровяного сгустка, полученная посредством «естественного» процесса коагуляции без каких-либо добавок, а посредством механической обработки собственной крови пациента (то есть центрифугирования). Он состоит из полимеризованной фибриновой сети, включающей определённую популяцию клеток (преимущественно лейкоцитов) и тромбоциты. Его следует рассматривать как оптимизированный кровяной сгусток или трансплантат живой человеческой ткани благодаря:

• его физическим характеристикам: трехмерная фибриновая сеть делает мембраны достаточно прочными для наложения швов и фиксации (например, с помощью пинов)
• наличию клеток и медиаторов, заключённых в трёхмерной фибриновой сетке
• длительному высвобождению факторов роста, способствующих восстановлению/регенерации тканей
• его антибактериальной (бактериостатической) способности
• его полностью аутогенной природе

Поскольку клетки в L-PRF должны быть активированы, но не должны быть повреждены в процессе подготовки, необходимо строго соблюдать ряд специфических рекомендаций. Это включает: правильную скорость и продолжительность центрифугирования, правильные пробирки для крови (стеклянные пробирки или пластиковые пробирки с силика-покрытием для стимуляции естественной коагуляции), оптимальное время и подходящую центрифугу (например, устройство и его стабильность).

Эволюция концентратов тромбоцитов (PC)

Было представлено четыре варианта концентратов тромбоцитов: два типа плазмы, богатой тромбоцитами (PRP), представляющие собой жидкие суспензии тромбоцитов, которые после активации могут превращаться в мягкий фибриновый гель, и два типа фибрина, богатого тромбоцитами (PRF), представляющие собой твёрдые сгустки тромбоцитов и фибрина (вследствие сильно полимеризованной фибриновой сети). На основе содержания лейкоцитов и структуры фибрина концентраты тромбоцитов можно классифицировать на четыре основные категории (Dohan Ehrenfest и соавт.²˒³):

• Чистая плазма, богатая тромбоцитами (P-PRP), без лейкоцитов и с фибриновой сетью низкой плотности
• Плазма, богатая лейкоцитами и тромбоцитами (L-PRP), с лейкоцитами (их количество зависит от протокола) и с фибриновой сетью низкой плотности
• Чистый фибрин, богатый тромбоцитами (P-PRF), без лейкоцитов и с фибриновой сетью высокой плотности
• Фибрин, богатый лейкоцитами и тромбоцитами (L-PRF), с лейкоцитами (их количество зависит от протокола) и с фибриновой сетью высокой плотности

Сам по себе акроним PRF предпочтительно не использовать, так как он относится к широкому спектру продуктов типа PRF (включая P-PRF) с различиями в клеточном составе, характере высвобождения факторов роста и биологической активности.
Как показано в следующем разделе, современные концентраты тромбоцитов являются результатом длительного периода развития, направленного на получение более прочных и на 100% аутогенных биоактивных соединений, которые могут быть приготовлены непосредственно у стоматологического кресла с помощью простого протокола.

Важное замечание

Акроним L-PRF будет использоваться для обозначения всех протоколов центрифугирования типа L-PRF (включая L-PRF, A-PRF, A-PRF+ и т.д.), за исключением случаев, когда они сравниваются между собой. При детальном анализе клинических исследований (например, в таблицах) будет сохраняться акроним, использованный в оригинальной статье.

История концентратов тромбоцитов начинается с работ Matras⁴–⁶ в 1970-х годах, в которых сообщалось о положительном влиянии фибриновых гелей на заживление кожных ран. В последующие годы (с 1975 по 1979) были введены новые формы тромбоцитарно-фибринового геля (смесь тромбоцитов, фибриногена и тромбина или тромбоцитарный желатин), показавшие определённые преимущества в офтальмологии, общей хирургии и нейрохирургии. В середине и конце 1980-х годов Knighton и соавторы⁷ разработали схожую концепцию (названную факторами заживления ран, производными тромбоцитов), также направленную на улучшение заживления кожных язв.

PRP: первое поколение концентратов тромбоцитов

В конце 1990-х годов Whitman и соавторы⁹ и Marx и соавторы¹⁰ первыми начали продвигать использование PRP в челюстно-лицевой хирургии. Эти жидкие суспензии тромбоцитов получали с помощью сложной процедуры, включающей использование добавок. Кровь пациента сначала обрабатывается антикоагулянтами, а затем на более позднем этапе — активаторами коагуляции в ходе двух этапов центрифугирования. Основной целью PRP было выделение максимального количества тромбоцитов и факторов роста. Несмотря на многочисленные модификации протокола на протяжении лет, на сегодняшний день стандартизированный протокол его подготовки и применения по-прежнему отсутствует.

PRP содержит более 95% тромбоцитов из исходного образца крови и оказывает прямое воздействие на остеобласты, клетки соединительной ткани, клетки периодонтальной связки и эпителиальные клетки (Marx¹). К сожалению, PRP имеет ряд ограничений, которые препятствовали его широкому применению, включая:

• Сложность подготовки со значительными межоператорскими вариациями
• Необходимость использования антикоагулянтов для предотвращения свертывания на начальном этапе процесса
• Необходимость последующего применения активаторов коагуляции (в основном бычьего тромбина и хлорида кальция), оба из которых известны как ингибиторы заживления ран
• Длительное время подготовки (от 30 до 60 минут и более)
• Жидкая форма, требующая сочетания с другими, зачастую синтетическими, биоматериалами
• Быстрое («всплесковое») высвобождение факторов роста (Kobayashi и соавт.)
• Высокая стоимость

Хорошо известным примером PRP является плазма, богатая факторами роста (PRGF), впервые представленная Anitua и соавторами. Подобно PRP, этот концентрат тромбоцитов требует внешних добавок для обработки и имеет ряд ограничений, включая жидкую форму и сложность приготовления.

На сегодняшний день всё ещё наблюдается явный недостаток научных данных о положительных эффектах PRP (Roselló-Camps и соавт., Pocaterra и соавт., Stähli и соавт., Franchini и соавт., Donos и соавт.), главным образом из-за значительной вариабельности дизайнов исследований (небольшие группы пациентов, отсутствие контрольных групп), а также протоколов подготовки. Кроме того, необходимость использования животного тромбина в качестве коагулянта (или других добавок) вызывает правовые вопросы в некоторых странах. Недавний систематический обзор, представленный на Пятой Консенсусной конференции Европейской ассоциации остеоинтеграции (EAO), сообщил об отсутствии последовательных доказательств, подтверждающих клиническую пользу PRP у здоровых пациентов, и предположил, что PRP «может» оказывать положительное влияние на заживление ран и регенерацию кости у пациентов с сопутствующими заболеваниями (Stähli и соавт.).

L-PRF: второе поколение концентратов тромбоцитов

В 2001 году Choukroun представил новую концепцию кровяного концентрата, первоначально названную PRF, но с 2009 года обозначаемую как L-PRF. Он стремился к упрощённой подготовке (меньше этапов, более быстрое выполнение) и получению продукта без вышеупомянутых недостатков PRP (Choukroun и соавт., Dohan и соавт.). В рамках этой новой концепции необходимость в антикоагулянтах была исключена, так что конечный продукт остаётся на 100% аутогенным. Более того, исключение антикоагулянтов позволило сохранить физиологические функции клеток без их ингибирования после центрифугирования. Таким образом, данный подход стал более подходящим для клинического применения. В 2003 году первый клинический опыт использования L-PRF был опубликован на французском языке во французском журнале.

Для данной техники периферическая кровь пациента собирается в специальные пробирки и немедленно обрабатывается путём одноступенчатого центрифугирования. Контакт крови с силикой в пластиковых пробирках с силика-покрытием или со стеклом в стеклянных пробирках активирует каскад коагуляции, что приводит к формированию прочного фибринового сгустка в процессе центрифугирования. После центрифугирования кровь разделяется на: фракцию эритроцитов (внизу), плазму (вверху) и сгусток L-PRF (в середине), который может быть извлечён из пробирки с помощью пинцета. После аккуратного удаления оставшихся эритроцитов из сгустка его можно сжать до состояния мембраны. И сгусток, и мембрана состоят из плотной трёхмерной фибриновой сети, обогащённой тромбоцитами и разнообразными лейкоцитами.

Последовательные этапы подготовки компонентов L-PRF:

Забор крови с использованием иглы-бабочки, проверка полного заполнения пробирки, вращение пробирок для запуска спонтанной коагуляции, помещение пробирок в центрифугу в течение 1 минуты (правильное расположение пробирок для обеспечения стабильности во время центрифугирования), центрифугирование при 408g (последние пробирки ≥ 12 минут), извлечение сгустков L-PRF (аккуратное удаление эритроцитов), компрессия сгустков в пробки и мембраны L-PRF, сбор экссудата L-PRF.

Таким образом, L-PRF представляет собой на 100% аутогенный биоматериал, богатый фибрином, тромбоцитами (> 80% от их содержания в исходном образце крови), лейкоцитами (> 75% от их содержания в исходном образце крови), факторами роста, цитокинами и другими компонентами, способствующими восстановлению тканей. L-PRF высвобождает интерлейкин-1, -4 и -6, а также другие факторы роста, включая трансформирующий фактор роста-β1 (TGF-β1), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), фактор роста, происходящий из тромбоцитов-AB (PDGF-AB), и костный морфогенетический белок (BMP)-1, -2 и -9. Эти компоненты эффективно регулируют пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток, связанных с восстановлением, и тем самым регулируют и стимулируют заживление и восстановление тканей. Лейкоциты способны высвобождать большое количество цитокинов, связанных с иммунной регуляцией, в процессе фибринолиза, и этот процесс является длительным и прогрессирующим (Anilkumar et al³³, He et al³⁴). Таким образом, L-PRF способствует заживлению ран и ускоряет регенерацию.

Два систематических обзора, выполненные Castro и соавторами, подтвердили клиническую значимость преимуществ L-PRF в пародонтальной терапии (например, лечение пародонтальных карманов, управление мягкими тканями, сохранение альвеолярного гребня, синус-лифтинг, остеоинтеграция). Недавний систематический обзор, представленный на Пятой Консенсусной конференции EAO (2018), сообщил о наличии умеренных доказательств, подтверждающих клиническую пользу L-PRF при сохранении альвеолярного гребня и на ранней стадии остеоинтеграции, и указал на необходимость дополнительных клинических данных для оценки роли L-PRF в других областях применения (Strauss et al³⁷). В то же время было опубликовано несколько дополнительных исследований, устраняющих этот недостаток доказательств, как будет обсуждаться далее.

Также важно отметить, что подготовка L-PRF для клинического применения является простой, недорогой, на 100% аутогенной и, следовательно, очень безопасной. L-PRF является результатом чисто механической обработки крови, создающей «оптимизированный» или «супер» кровяной сгусток.

Краткое изложение характеристик и эволюции концентратов тромбоцитов

Таблица 1 суммирует наиболее важные различия между PRP, PRGF и L-PRF (Giannini et al³⁸). Таблица 2 отражает историческую эволюцию концентратов тромбоцитов за последние 50 лет. Как указано выше, было предложено большое количество модификаций, и хотя некоторые из них действительно являются важными этапами развития, к сожалению, другие не имеют научных доказательств значимой клинической пользы.

Основные различия между тромбоцитарными концентратами первого (PRP, PRGF) и второго (L-PRF) поколений

	PRP (1998)	PRGF (2001)	L-PRF (2004)
Протокол	очень сложный	сложный	простой
Скорость	медленная	очень медленная	быстрая
Воспроизводимость	Возможная предвзятость	возможна предвзятость	без предвзятости
Использование антикоагулянтов	да	да	нет
100% аутогенность	нет	нет	да
Получаемый объем	Достаточный	Низкий	Хороший
Морфология фибрина	тетрамолекулярная	тетрамолекулярная	тримомолекулярная
Количество лейкоцитов	0%-50%	0%	≥65%
Иммуномодулирующие свойства	слабые	отсуствуют	присутствуют
Неоангиогенный потенциал	достаточный	хороший	очень хороший
Остеокондуктивный потенциал	слабый	слабый	высокий
Механические свойства (золь–гель–мембрана)	достаточные	слабые	хорошие
Наличие мезенхимальных стволовых клеток	да	да	да
стоимость протокола	высокая	высокая	низкая

Обзор эволюции концентратов тромбоцитов

Год	Событие
1954	Kingsley впервые использовал термин PRP для обозначения тромбоцитарного концентрата в ходе экспериментов, связанных со свертыванием крови.
1970	«Фибриновый клей», введённый Matras, улучшал заживление кожных ран в моделях на крысах. Фибриновый клей получали путём полимеризации фибриногена с тромбином и кальцием. Однако из-за низкой концентрации фибриногена в донорской плазме качество и стабильность фибринового клея были неоптимальными.
1975-1978	Rosenthal и соавторы представили усовершенствованный экстракт крови, называемый смесью тромбоцитов, фибриногена и тромбина, для герметизации роговичных ран.
1979	Впоследствии это вещество было названо желатиновым тромбоцитарным гелем (gelatin platelet-gel foam). Это новое предложение подтвердило эффективность тромбоцитов и продемонстрировало выдающиеся предварительные результаты в общей хирургии, нейрохирургии и офтальмологии. Однако на данном этапе все эти продукты использовались преимущественно из-за их «клеящего» эффекта, без учёта влияния факторов роста на их заживляющие свойства.
1986	Knighton и соавторы⁷ впервые продемонстрировали, что концентраты тромбоцитов успешно способствуют заживлению, и ввели термин факторы заживления ран, производные тромбоцитов (PDWHF). Метод успешно применялся для лечения кожных язв.
1988	Knighton и соавторы⁸ ввели несколько иной термин: формула заживления ран, производная тромбоцитов (PDWHF).
1997	Whitman и соавторы⁹ назвали свой продукт PRP на этапе приготовления, однако когда конечный продукт приобретал консистенцию фибринового геля, они обозначали его как тромбоцитарный гель.
1998	Развитие этих методов продолжалось медленно до публикации статьи Marx и соавторов¹⁰, которая вызвала широкий интерес к данным технологиям. Однако все эти продукты обозначались как PRP без учёта их состава или архитектуры, и такая недостаточная терминология сохранялась на протяжении многих лет. Некоторые коммерческие компании начали маркировать свои продукты собственными торговыми названиями.

Год	Событие
1999	Один из популярных методов получения чистого PRP, который был коммерциализирован и широко рекламировался (Anitua), представлял собой плазму, богатую факторами роста (PRGF; также называемую препаратом, богатым факторами роста; Endoret, BTI Biotechnology Institute). Однако из-за отсутствия точных этапов пипетирования, а также из-за недостаточной эргономики возникали значительные проблемы с этой техникой (Dohan Ehrenfest и соавт.).Другой широко продвигаемый метод получения P-PRP был коммерциализирован под названием Vivostat PRF. Несмотря на название, это не PRF, а продукт типа PRP
2000	Одновременно Choukroun и соавторы²⁰ разработали во Франции другую форму концентрата тромбоцитов, которая была обозначена как PRF, на основе сильной полимеризации фибринового геля. Она была названа «вторым поколением» концентратов тромбоцитов, поскольку явно отличалась от других PRP. Это стало важной вехой в развитии терминологии.
2006	Bielecki и соавторы⁴³ и Cieslik-Bielecka и соавторы⁴⁴˒⁴⁵ предложили определять PRP как неактивное вещество, тогда как гель, богатый тромбоцитами (PRG), рассматривался как более биологически активированная фибриновая матрица, богатая тромбоцитами, лейкоцитами и соответствующими активными молекулами.Sacco⁴⁶ представил новую концепцию концентрированных факторов роста (CGF). Для получения CGF из венозной крови использовалась скорость вращения в диапазоне 2400–2700 об/мин. Полученные фибриновые сгустки были значительно больше, богаче и плотнее.
2008	Everts и соавторы⁸ сосредоточили внимание на лейкоцитарном компоненте концентратов тромбоцитов и на двух их формах, то есть неактивированной и активированной. Неактивированный продукт был назван плазмой, богатой тромбоцитами и лейкоцитами (P-LP), а активированный гель — тромбоцитарно-лейкоцитарным гелем (PLG).
2009	Первая классификация концентратов тромбоцитов была предложена Dohan Ehrenfest и соавторами². Эта классификация определяла четыре основные группы на основе разделения продуктов по двум ключевым параметрам: клеточному составу (преимущественно лейкоцитам) и архитектуре фибрина: Чистая плазма, богатая тромбоцитами (P-PRP) или плазма, богатая тромбоцитами с низким содержанием лейкоцитов (LP-PRP)Плазма, богатая лейкоцитами и тромбоцитами (L-PRP)Чистый PRF (P-PRF) или PRF с низким содержанием лейкоцитовФибрин, богатый лейкоцитами и тромбоцитами (L-PRF)
2010	Sohn представил концепцию «липкой кости» (аутогенный фибриновый клей, смешанный с костным трансплантатом).
2012	Mishra и соавторы предложили другую классификацию, ограниченную PRP и применимую только в спортивной медицине. Они выделили четыре типа PRP на основе наличия или отсутствия лейкоцитов и активации PRP:L-PRP растворL-PRP гельP-PRP растворP-PRP гельТермин «раствор» означает неактивированный PRP, а «гель» — активированный PRP.Примерно в то же время DeLong и соавторы предложили другую систему классификации под названием PAW (количество тромбоцитов, способ активации, наличие лейкоцитов). Однако она также была ограничена семейством PRP и была схожа с классификацией Mishra и соавторов.
2012	Pintos представил концепцию Natural Guided Regeneration Therapy для лечения хронических ран с использованием L-PRF.
2013	Tunali и соавторы представили новый продукт под названием T-PRF — L-PRF, получаемый в титановых пробирках для крови.
2014	Ghanaati и соавторы представили усовершенствованный PRF под названием A-PRF (предположительно содержащий больше моноцитов).
2015	Mourão и соавторы опубликовали подробную техническую заметку по получению инъекционного PRF (i-PRF).
2017	Fujioka-Kobayashi и соавторы представили усовершенствованный L-PRF под названием A-PRF+ (предположительно содержащий ещё больше клеток крови).

2018	Cortellini и соавторы представили L-PRF костный блок — комбинацию измельчённых мембран L-PRF, костного заменителя и жидкого фибриногена. Эта комбинация обеспечила значительные преимущества в регенерации кости.
2019	Miron и соавторы представили C-PRF — концентрированный PRF в жидкой форме.
2020	Fujioka-Kobayashi и соавторы представили H-PRF — PRF, получаемый с использованием горизонтальной центрифуги, что обеспечивает более равномерное распределение тромбоцитов и лейкоцитов по всей мембране.

Состав крови

Наша кровь представляет собой смесь примерно 55% плазмы и 45% форменных элементов крови. Она составляет около 7–8% общей массы тела и в среднем составляет приблизительно 5 л. Здоровый взрослый человек может потерять почти 20% объёма крови (1 л) до появления первых симптомов (например, беспокойства) и примерно 40% объёма (2 л) до развития гиповолемического шока.

Важное замечание

Это указывает на то, что для пациента не должно представлять серьёзной проблемы сдача до 24 пробирок крови (примерно 240 мл) для приготовления мембран, богатых лейкоцитами и тромбоцитами (L-PRF). Такое количество иногда требуется для крупных процедур направленной костной регенерации или для лечения обширных хронических внеполостных ран.

Эритроциты (RBC) составляют около 40–45% объёма крови, тогда как лейкоциты (WBC) составляют менее 1%. Тромбоциты (< 1%), в отличие от эритроцитов и лейкоцитов, не являются клетками, а представляют собой небольшие клеточные фрагменты (также называемые тромбоцитами).

Несмотря на то что эритроциты меньше лейкоцитов, при центрифугировании они смещаются на дно пробирок, поскольку обладают большей плотностью (более высоким удельным весом). Относительная доля эритроцитов, измеряемая с помощью гематокрита, различается у мужчин и женщин. В норме она составляет 40,7–50,3% у мужчин (4,7–6,1 млн клеток на мкл) и 36,1–44,3% у женщин (4,2–5,4 млн клеток на мкл). На индивидуальном уровне значение гематокрита снижается у мужчин в шестом десятилетии жизни, а у женщин — в седьмом десятилетии, и это изменение становится более выраженным с возрастом, особенно у мужчин (Woodman и соавт.; Zeng и соавт.).

Важное замечание

Индивидуальные вариации, а также различия, связанные с полом и возрастом, в значениях гематокрита будут влиять на конечный размер мембран L-PRF: чем ниже гематокрит, тем больше размер мембран L-PRF.

Таблицы суммирует важную информацию о компонентах крови.

Источники:

1. Woodman R, Ferrucci L, Guralnik J. Anemia in older adults. Curr Opin Hematol 2005;12:123-128. PMID: 15725902.
2. Zeng SM, Yankowitz), Widness JA, Strauss RG. Etiology of differences in hematocrit between males and females:Sequence-based polymorphisms in erythropoietin and its receptor. J Gend Specif Med 2001:4:35-40. PMID: 11324238.
3. MaderS. Lab Manual for Human Biology, ed 14 New York McGraw-Hill, 2016.
   

Статья подготовлена на основе публикаций автора Joseph Choukroun — Концепция низкоскоростного центрифугирования