Фазы заживления ран

Основным преимуществом применения плазмы, богатой лейкоцитами и тромбоцитами (L-PRF), является её выраженное положительное влияние на заживление ран и восстановление тканей. Для того чтобы помочь читателю понять эти преимущества, в данном разделе представлено упрощённое описание процесса заживления ран.

В неповреждённой коже эпидермис (поверхностный слой) и дерма (более глубокий слой) образуют защитный барьер от внешней среды. При нарушении этого барьера запускается регулируемая последовательность биохимических событий, направленных на восстановление повреждения. Этот процесс делится на предсказуемые фазы (Gurtner и соавт.¹ и Guo и Dipietro²; для более подробной информации см. Kumar и соавт.³): свёртывание крови (гемостаз), воспаление, рост ткани (пролиферация) и ремоделирование ткани (созревание), как показано на рис. 2-1. Первая стадия — свёртывание крови — иногда рассматривается как часть стадии воспаления, а не как отдельная стадия.

Фазы заживления

Фаза 1: Гемостаз

Гемостаз начинается немедленно при возникновении повреждения с целью остановки кровотечения. Система свёртывания крови действует как биологический «набор первой помощи», формируя временную преграду (тромб) для остановки кровотечения. В этом процессе ключевую роль играют тромбоциты. При контакте с коллагеном они активируются и начинают агрегироваться. Фермент тромбин инициирует образование фибриновой сети, которая укрепляет скопления тромбоцитов, формируя стабильный сгусток, закрывающий повреждение кровеносного сосуда, замедляя или предотвращая дальнейшее кровотечение. Этот процесс будет подробно рассмотрен в разделе «Гемостаз» далее в этой главе.

Фаза 2: Воспаление

Данная фаза направлена на уничтожение бактерий и удаление остатков из раны. По сути, она подготавливает раневое ложе к росту новой ткани и начинается сразу после первой фазы. Сначала полиморфноядерные нейтрофилы поступают в рану для устранения бактерий и клеточного детрита. Их количест во обычно достигает пика между 24 и 48 часами после повреждения и значительно уменьшается спустя 3 дня. По мере их исчезновения моноциты инфильтрируют рану и дифференцируются в макрофаги, которые продолжают очищение раны от детрита. Эти клетки также секретируют факторы роста и белки, привлекающие клетки иммунной системы в область раны, способствуя восстановлению тканей. Эта фаза длится примерно 4–6 дней и часто сопровождается с отеком, эритемой, повышением температуры и болью. В течение этих дней факторы роста, происходящие из тромбоцитов, высвобождаются в рану, вызывая миграцию и деление клеток в пролиферативной фазе.

При воспалительных реакциях предшественники в костном мозге продуцируют моноциты, которые поступают в кровь и различные ткани, где дифференцируются в макрофаги (рис. 2-2). Существует два основных пути активации макрофагов (Winkler и соавт.): классическая активация (M1), которая может быть вызвана внешней угрозой, и альтернативная активация (M2), регулируемая Т-лимфоцитами. Последние макрофаги не обладают выраженной микробицидной активностью; вместо этого функция альтернативно активированных макрофагов (M2) заключается в восстановлении тканей (Champagne и соавт.). Они секретируют факторы роста, которые, как показано в исследованиях in vitro, способствуют ангиогенезу, активируют фибробласты, стимулируют синтез коллагена и способствуют остеогенной минерализации. Концепция макрофагов M1 и M2 предоставляет полезную основу для понимания их гетерогенности, однако также были описаны многочисленные другие субпопуляции.

Хотя продукты активированных макрофагов устраняют повреждающие агенты и инициируют процесс восстановления, они также частично ответственны за повреждение тканей при хроническом воспалении. Эпителиальные и стромальные клетки также следует рассматривать как участники этого процесса, поскольку они могут продуцировать некоторые из тех же факторов роста.

Фаза 3: Пролиферация

После очищения раны начинается пролиферативная фаза, сосредоточенная на заполнении, сокращении и покрытии раны. В этой фазе происходят ангиогенез, отложение коллагена, образование грануляционной ткани, сокращение раны и эпителизация. При ангиогенезе эндотелиальные клетки сосудов формируют новые кровеносные сосуды. В процессе фиброплазии и формирования грануляционной ткани формировании грануляционной ткани фибробласты растут и формируют новую временную внеклеточную матрицу (ECM), выделяя коллаген и фибронектин. Блестящая тёмно-красная грануляционная ткань заполняет рану. В процессе сокращения раны миофибробласты уменьшают её размер, стягивая края раны и сокращаясь посредством механизма, сходного с механизмом гладкомышечных клеток. Одновременно происходит реэпителизация эпидермиса. Эпителиальные клетки пролиферируют и «ползут» из раневого ложа или краёв раны по её поверхности, обеспечивая покрытие новой ткани. Когда роль клеток близка к завершению, ненужные клетки подвергаются апоптозу. Пролиферативная фаза обычно длится от 4 до 24 дней.

Фаза 4: Созревание/ремоделирование

В ходе этой фазы вновь образованная ткань постепенно приобретает прочность и эластичность в процессе ремоделирования. Коллагеновые волокна реорганизуются, а ткань перестраивается и созревает с общим увеличением прочности на растяжение, при этом максимальная прочность ограничена примерно 80% от уровня до повреждения. Фаза созревания значительно варьирует в зависимости от раны и может длиться от 21 дня до 2 лет.

Этот процесс заживления является очень сложным (обобщён на рис. 2-3). Кроме того, он подвержен нарушению под воздействием многих местных факторов, включая влажность, инфекцию и мацерацию, а также системных факторов, таких как возраст, нутритивный статус, медикаментозная терапия и тип телосложения. Факторами, способствующими формированию незаживающих хронических ран, являются сахарный диабет, венозная или артериальная недостаточность, инфекция и метаболические нарушения, связанные со старением.

Выживание организма зависит от его способности восстанавливать повреждения, вызванные токсическими агентами и/или сопутствующим воспалением. Восстановление тканей происходит двумя путями: (1) регенерация за счёт пролиферации оставшихся клеток и созревания ткани или (2) отложение соединительной ткани с образованием рубца. Регенерация, включающая пролиферацию и дифференцировку клеток, регулируется факторами роста и в значительной степени зависит от организации внеклеточной матрицы (ECM). В процессе восстановления тканей пролиферируют несколько типов клеток. К ним относятся: (1) остатки повреждённой ткани, стремящиеся восстановить нормальную структуру, (2) эндотелиальные клетки сосудов, необходимые для образования новых сосудов, обеспечивающих поступление питательных веществ, необходимых для процесса восстановления, и (3) фибробласты, являющиеся источником фиброзной ткани, заполняющей дефекты, которые не могут быть устранены путём регенерации (Kumar и соавт.³).

Ангиогенез, то есть образование новых кровеносных сосудов из уже существующих, играет ключевую роль в восстановлении тканей. Этот процесс включает несколько сигнальных путей, межклеточную коммуникацию, взаимодействие белков внеклеточной матрицы и тканевых ферментов. Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) играет важную роль в инициации этого процесса. Он стимулирует как миграцию, так и пролиферацию эндотелиальных клеток, тем самым инициируя образование капиллярных выростов. Другие факторы роста, такие как фактор роста, происходящий из тромбоцитов (PDGF), и трансформирующий фактор роста бета (TGF-β), также участвуют в этом процессе, привлекая гладкомышечные клетки и усиливая продукцию белков внеклеточной матрицы (Morgan и Nigam).

Пролиферация клеток определяется сигналами, поступающими от внеклеточной матрицы (ECM) и факторов роста. Факторы роста обычно продуцируются клетками, расположенными вблизи зоны повреждения.
Наиболее важными источниками факторов роста являются макрофаги, активируемые после повреждения ткани. Макрофаги происходят из гемопоэтических стволовых клеток, которые в циркулирующей крови известны как моноциты. Макрофаги специализируются на фагоцитозе микроорганизмов и стареющих клеток, но также выполняют множество других функций в воспалении и восстановлении тканей.

Существует спектр формирования рубца: на одном конце находится безрубцовая регенерация, в центре — «нормальное» рубцевание, а на другом конце — патологическое рубцевание, включая гипертрофические и келоидные рубцы (Marshall и соавт.). Келоидные и гипертрофические рубцы в значительной степени определяют заболеваемость, связанную с рубцеванием после хирургических вмешательств. Гипертрофический рубец можно определить как рубец, формирующийся после повреждения, который больше или более возвышается, чем обычно, или приводит к контрактуре. Гипертрофический рубец чаще возникает после инфицирования раны, при её закрытии с чрезмерным натяжением или при расположении раны в областях кожи с высоким естественным натяжением (таких как плечи, шея и грудина). Келоидные рубцы, напротив, представляют собой аномально выраженную реакцию рубцевания, распространяющуюся за пределы исходного повреждения. Келоиды сопровождаются зудом и гиперестезией и имеют тенденцию к рецидиву после иссечения, в отличие от гипертрофических рубцов, которые могут не рецидивировать при адекватной коррекции. В то время как гипертрофические рубцы часто уплощаются в течение нескольких лет, келоидные рубцы обычно не регрессируют.

Даже у взрослого человека слизистая оболочка полости рта способна заживать после повреждения с минимальным рубцеванием, напоминая регенеративное заживление кожи плода (Marshall и соавт.). Несмотря на то что рана слизистой оболочки полости рта проходит те же стадии заживления, что и кожная рана, начальная воспалительная реакция выражена слабее, а общая скорость заживления выше. Наличие слюны ускоряет заживление ран кожи у мышей, и у мышей, перенёсших сиаладенэктомию и имеющих возможность облизывать свои раны, заживление происходило медленнее, чем у контрольной группы, что указывает на то, что отсутствие нормальной слюны тормозит процесс заживления (Bodner и соавт.). Внеполостные ткани, трансплантированные в полость рта, остаются гистологически отличными от слизистой оболочки и формируют рубцовую ткань. Кроме того, недавние эксперименты показали, что дермальные фибробласты, обладающие «рубцующим фенотипом», трансплантированные в слизистую оболочку полости рта, формируют более выраженную рубцовую соединительную ткань по сравнению с фибробластами слизистой оболочки полости рта, трансплантированными в дерму (Rinkevich и соавт.). В совокупности эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что факторы, присущие клеткам слизистой оболочки полости рта, в значительной степени определяют снижение рубцевания в этой ткани.

Важное замечание

Важно понимать, что тромбоциты (присутствующие в высоких концентрациях в мембранах L-PRF) играют ключевую роль на ранних этапах регенерации тканей (в фазе гемостаза и формирования фибринового сгустка). Кроме того, они секретируют ряд важных факторов роста, включая PDGF, VEGF, факторы коагуляции, молекулы адгезии, цитокины/хемокины и различные другие ангиогенные факторы, способные стимулировать пролиферацию и активацию клеток, участвующих в процессе заживления ран, включая фибробласты, нейтрофилы, макрофаги и мезенхимальные стволовые клетки (Nurden¹⁰). Таким образом, неудивительно, что мембраны L-PRF способны положительно стимулировать/облегчать заживление ран и/или восстановление тканей.

Гемостаз

Гемостаз (прекращение кровотечения после повреждения) является первой стадией заживления ран и включает переход крови из жидкого состояния в гелеобразное (то есть свёртывание крови). В нормальных условиях эндотелиальные клетки предотвращают свёртывание крови за счёт секреции ингибиторов коагуляции и агрегации тромбоцитов. Однако после повреждения (или разрыва) эндотелия эндотелиальные клетки прекращают секрецию этих ингибиторов и вместо этого выделяют фактор фон Виллебранда (vWF), который инициирует гемостаз. Гемостаз включает четыре основных этапа 

Рис. 2-4 Четыре основных этапа гемостаза. (a) Сразу после сосудистого повреждения возникает кратковременная вазоконстрикция за счёт сокращения гладкомышечных клеток в стенке кровеносных сосудов. (b) Тромбоциты крови (серые) связываются с фактором фон Виллебранда (vWF) на обнажённой базальной мембране и активируются (то есть изменяют форму, становятся липкими и высвобождают гранулы). Эти гранулы (аденозиндифосфат [ADP], тромбоксан A2 [TXA2], серотонин) привлекают дополнительные тромбоциты, способствуя их агрегации и формированию тромбоцитарной пробки (то есть первичный гемостаз), а также высвобождению дополнительных химических веществ (создавая петлю положительной обратной связи). (c) Запускается локальный каскад коагуляции (подробнее описан далее в этой главе), включающий тканевой фактор и фосфолипиды тромбоцитов, что приводит к полимеризации фибрина (синий), «цементирующего» тромбоциты в прочную вторичную гемостатическую пробку. (d) Формирование плотной пробки (за счёт сокращения), активация контррегуляторных механизмов, ограничивающих свёртывание областью повреждения (например, тканевой активатор плазминогена [t-PA], секретируемый эндотелиальными клетками), и последующая резорбция сгустка. (Адаптировано по Park и Koh¹²).

Этапы: (1) артериолярная вазоконстрикция, (2) временная закупорка повреждения сосуда тромбоцитарной пробкой (первичный гемостаз), (3) образование фибринового сгустка и (4) резорбция сгустка (рис. 2-4). Эти процессы герметизируют повреждение до тех пор, пока ткани не будут восстановлены (подробности см. Park и Koh и Kumar и соавт.¹²).

Артериолярная вазоконстрикция

 В качестве первой и немедленной реакции после сосудистого повреждения кровеносный сосуд сужается, чтобы уменьшить кровопотерю (то есть за счёт сокращения гладкомышечных клеток сосудистой стенки

Их сократительные свойства регулируются самим сосудистым эндотелием. Это опосредуется рефлекторными нейрогенными механизмами и усиливается местной секрецией таких факторов, как эндотелин — мощный вазоконстриктор, продуцируемый эндотелием.

Формирование тромбоцитарной пробки: первичный гемостаз (агрегация тромбоцитов)

В нормальных условиях тромбоциты крови не адгезируются ни друг к другу, ни к стенке кровеносного сосуда. Повреждение эндотелия приводит к обнажению субэндотелиального коллагена и фактора фон Виллебранда (vWF). Оба фактора способствуют адгезии и активации тромбоцитов. Активированные тромбоциты изменяют форму (с округлых дисков на плоские структуры с липкими отростками) и высвобождают цитоплазматические гранулы, такие как аденозиндифосфат (ADP, который привлекает дополнительные тромбоциты к поражённой области), серотонин (вазоконстриктор) и тромбоксан A2 (TXA2, который способствует агрегации тромбоцитов, вазоконстрикции и дегрануляции). По мере высвобождения большего количества химических веществ всё больше тромбоцитов прилипают и выделяют свои медиаторы, формируя тромбоцитарную пробку и поддерживая процесс в виде петли положительной обратной связи (цепной реакции). Таким образом, одни только тромбоциты способны останавливать кровотечение при ежедневных микроповреждениях кожи. Этот процесс называется первичным гемостазом.

Образование сгустка: вторичный гемостаз (формирование тромбоцитарного сгустка)

После формирования тромбоцитарной пробки факторы свёртывания (около десятка белков, циркулирующих в плазме крови в неактивном состоянии) активируются в последовательности протеолитических реакций, известной как каскад коагуляции. Эти реакции в основном локализуются на поверхности активированных тромбоцитов. Активация инициируется тканевым фактором (TF) — мембраносвязанным гликопротеином субэндотелиальных клеток стенки сосуда (например, гладкомышечных клеток и фибробластов). Это приводит к образованию трёхмерной фибриновой сети из неактивного фибриногена (плазменного белка). Таким образом, вокруг тромбоцитарной пробки формируется фибриновая сеть, фиксирующая её на месте (так называемый вторичный гемостаз). В ходе этого процесса также захватываются эритроциты и лейкоциты, что делает первичную пробку более прочной. Образовавшаяся пробка называется тромбом или сгустком.

Стабилизация и резорбция сгустка (антитромботические процессы)

Полимеризованный фибрин и агрегаты тромбоцитов подвергаются сокращению, формируя плотную, устойчивую пробку, предотвращающую дальнейшее кровотечение. На этом этапе запускаются контррегуляторные механизмы, ограничивающие свёртывание областью повреждения (например, тканевой активатор плазминогена [t-PA], обладающий фибринолитической активностью, секретируется эндотелиальными клетками, а тромбомодулин — интегральный мембранный белок, служащий кофактором тромбина — экспрессируется на поверхности эндотелиальных клеток). В конечном итоге это приводит к резорбции сгустка и восстановлению тканей.

Важное замечание

Эндотелиальные клетки являются центральными регуляторами гемостаза (баланс между антитромботической и протромботической активностью эндотелия определяет, произойдёт ли образование, распространение или растворение тромба). Тромбоциты играют ключевую роль в гемостазе, формируя первичную пробку, которая первоначально закрывает сосудистый дефект, а также обеспечивая поверхность для связывания и концентрации активированных факторов свёртывания в каскаде коагуляции.

Свёртывание крови

 Поскольку свёртывание крови является важным этапом в подготовке концентратов тромбоцитов второго поколения, в данном разделе кратко рассматривается этот процесс. Свёртывание крови in vivo включает активацию, адгезию и агрегацию тромбоцитов, а также отложение и созревание фибрина (то есть каскад коагуляции).

Каскад коагуляции можно представить как танец, в котором факторы свёртывания передаются от одного «партнёра» к другому, в конечном итоге приводя к отложению нерастворимого фибринового сгустка. Каждый этап включает фермент (активированный фактор свёртывания), субстрат (неактивную форму фактора свёртывания) и кофактор (ускоритель реакции). Эти компоненты собираются на отрицательно заряженной фосфолипидной поверхности активированных тромбоцитов.

Каскад коагуляции может активироваться через внутренний путь (также известный как путь контактной активации) и/или внешний путь (то есть путь тканевого фактора), оба из которых приводят к одной и той же реакции (общий путь) с образованием фибрина. Во внутреннем пути все компоненты уже присутствуют в крови, тогда как во внешнем пути необходим тканевой фактор (TF), секретируемый повреждёнными клетками.

Каскад коагуляции является достаточно сложным и включает несколько петель обратной связи. В следующих абзацах представлены упрощённые схемы (подробности см. Park и Kohl и Kumar и соавт.¹²).

Внешний (TF) путь (рис. 2-5)

Этот путь называется внешним, поскольку требует выхода крови в субэндотелиальное пространство.
После повреждения сосуда циркулирующий фактор VII вступает в контакт с TF (интегральным мембранным белком клеточной поверхности, присутствующим в субэндотелиальной ткани и лейкоцитах), образуя активированный комплекс (TF–фактор VIIa).
TF экспрессируется клетками, несущими TF (стромальные фибробласты, гладкомышечные клетки сосудов, лейкоциты). Комплекс TF–фактор VIIa активирует фактор IX и фактор X.
С этого момента начинается общий путь.

Внутренний (контактный) путь (рис. 2-6)

Внутренний путь инициируется активацией фактора XII под воздействием некоторых отрицательно заряженных искусственных поверхностей, включая стекло (например, стеклянные пробирки для крови или пластиковые пробирки с силика-покрытием). Высокомолекулярный кининоген и прекалликреин — два белка крови, способствующие этой активации. Ферментативная форма фактора XII (фактор XIIa) катализирует превращение фактора XI в его активную форму (фактор XIa). Фактор XIa катализирует превращение фактора IX в активированную форму — фактор IXa.

Фактор IXa образует комплекс с фактором VIII. Комплекс фактор IXa–фактор VIII связывается с фактором X, который активируется до фактора Xa. С этого момента начинается общий путь.

Рис. 2-6 In vitro свёртывание крови инициируется либо отрицательно заряженным веществом (например, стеклянной поверхностью), либо источником тканевого фактора (TF) (аналогично внешнему пути). Во время подготовки L-PRF стеклянная поверхность или силика-покрытие внутри пробирок для крови ответственны за инициацию процесса коагуляции. Красные полипептиды — неактивные факторы, синие — активные факторы, зелёные — кофакторы. Конечным этапом также является превращение фибриногена в фибрин.

Важное замечание

Внутренний путь протекает в пробирках для крови (пластиковых с силика-покрытием или стеклянных), используемых для подготовки L-PRF. Некоторые пластиковые или силиконовые поверхности не обладают этим свойством (например, пробирки с белой крышкой системы Intra-Lock). Они используются в случаях, когда необходимо замедлить каскад коагуляции, например, при получении жидкого фибриногена, необходимого для подготовки костного блока L-PRF.

Общий путь

Фактор X расщепляется фактором VIIa с образованием фактора Xa. Протромбин, связанный с гликопротеином IIb/IIIa на поверхности активированных тромбоцитов, превращается в тромбин под действием Xa (фактор Va и ионы кальция являются кофакторами этой реакции). Однако на начальной стадии коагуляции этим путём образуется лишь небольшое количество тромбина. Следовые количества тромбина, образующиеся на стадии инициации, обеспечивают дополнительную активацию тромбоцитов, фактора V и фактора XI. Большие количества тромбина образуются на стадии амплификации (Monkovic и Tracy¹³, Hoffman и Monroe¹⁴). Образование комплекса, включающего факторы VIIIa, IXa и ионы кальция на поверхности тромбоцитов, приводит к масштабной генерации фактора Xa. Фактор Xa вместе с фактором Va и ионами кальция образует комплекс протромбиназы, который обеспечивает «всплеск» тромбина, необходимый для превращения фибриногена в фибрин. Кроме того, тромбин активирует фактор XIII, что приводит к стабилизации сгустка, а также ингибитор фибринолиза, активируемый тромбином, который регулирует процессы фибринолиза (Green¹⁵).

Рис. 2-7
Пошаговое формирование нерастворимой сшитой полимерной сети фибрина. (Адаптировано по Riley и соавт.¹⁵)

Образование фибрина

Фибриноген (фактор I) — это гликопротеин, циркулирующий в крови человека. После повреждения тканей и сосудов он ферментативно превращается под действием тромбина в фибрин, а затем — в фибриновый кровяной сгусток. Фибриновые сгустки в первую очередь служат для окклюзии кровеносных сосудов с целью остановки кровотечения. Фибрин также связывает тромбин и снижает его активность. Эта активность, иногда называемая антитромбином I, ограничивает свёртывание крови.

Фибриноген синтезируется и секретируется в кровь преимущественно гепатоцитами. Зрелый фибриноген представляет собой длинную гибкую белковую структуру из трёх узлов, соединённых очень тонкой нитью (рис. 2-7). Два концевых узла (называемые D-областями или доменами) идентичны и состоят из цепей Bβ и γ, тогда как несколько меньший центральный узел (называемый E-областью или доменом) состоит из двух переплетённых цепей Aα. Длина высушенной молекулы фибриногена составляет 47,5 ± 2,5 нм. Активация каскада коагуляции в конечном итоге приводит к образованию мономеров фибрина, которые усиливают первоначальную тромбоцитарную пробку за счёт спонтанной агрегации в фибриллы «конец к концу» и «бок о бок» (Riley и соавт.¹⁶; см. рис. 2-7). Фибриноген превращается в мономеры фибрина посредством отщепления двух небольших фрагментов (фибринопептидов A и B, маленькие синие кружки на рис. 2-7) под действием тромбина. В ходе этого процесса отрицательный заряд E-домена фибриногена (красный кружок на рис. 2-7) превращается в положительный, что позволяет мономерам фибрина спонтанно полимеризоваться в полимер, стабилизированный водородными связями.

Тромбин также активирует циркулирующий в крови фермент трансглутаминазу — фактор XIII, который стабилизирует первоначальный фибриновый полимер, катализируя образование сшитых ковалентных связей между соседними D-доменами (оранжевые линии на рис. 2-7).

Основные принципы центрифугирования крови

Центрифуга — это устройство, которое вращает жидкие образцы с высокой скоростью с целью создания сильной центростремительной силы, вызывающей более быстрое перемещение более плотных материалов к дну пробирки (наружу в радиальном направлении), чем это происходило бы под действием обычной силы тяжести. Частицы с различной плотностью осаждаются в разных слоях: наиболее плотные — на дне пробирки, а наименее плотные — в верхней её части.

При центрифугировании крови в центрифуге с фиксированным углом наклона клетки сначала перемещаются к задней стенке пробирки, а затем вниз/вверх в зависимости от их плотности. Разделение происходит под углом, соответствующим фиксированному углу, под которым пробирки вращаются вокруг оси ротора (рис. 3-1).

Плотность (более точно — объёмная массовая плотность или удельная масса) вещества — это его масса на единицу объёма. Для чистого вещества плотность имеет то же числовое значение, что и его массовая концентрация.

Иногда используется относительная плотность или удельный вес — отношение плотности материала к плотности стандартного вещества, обычно воды. Относительная плотность меньше 1 означает, что вещество будет плавать в воде. Наиболее широко используемой системой измерения плотности (Международная система единиц) является килограмм на кубический метр (кг/м³).

Miron и соавторы¹ недавно обобщили физические свойства различных компонентов крови (табл. 3-1). По сравнению с водой (плотность 1000 при 4°C или 1030 для солёной воды), клетки крови имеют более высокую плотность. Эритроциты обладают наибольшей плотностью, значительно превышающей плотность лейкоцитов и тромбоцитов.

Рис. 3-1 (a) Разделение клеток в пробирке с кровью после

 центрифугирования (12 минут при g) в центрифуге с фиксированным углом (оригинальный протокол L-PRF). Каскад коагуляции активируется за счёт внутренней стеклянной поверхности (или силика-покрытия) пробирки с целью формирования сгустка. Клетки отталкиваются от центра ротора (влево на данной схеме), а затем перемещаются вниз (в зависимости от их удельной массы). Эритроциты (RBCs) оставляют следы на внутренней поверхности пробирки при прижатии к её стенке (красная пунктирная линия). (b) Пробирка с кровью после центрифугирования. Угол между тремя зонами (эритроциты внизу, сгусток L-PRF в середине, бесклеточная плазма сверху) зависит от угла наклона пробирки в центрифуге. (c) Схематическое изображение пробирки после центрифугирования с приблизительным распределением клеток крови и тромбоцитов: лейкоциты (белые кровяные клетки, WBCs) в основном концентрируются на границе между эритроцитами и сгустком L-PRF (будущая поверхность мембраны); тромбоциты распределены по всему сгустку, но их количество уменьшается по мере удаления от границы между эритроцитами и сгустком L-PRF; эритроциты плотно упакованы в нижней красной части, но частично присутствуют и в других зонах. (d) При заборе крови для стандартного медицинского анализа пробирки часто содержат антикоагулянты для предотвращения образования сгустка, в результате чего после центрифугирования получается иное разделение крови. Морфология клеток в пунктах c и d приведена в табл. 1-1. 

Последние демонстрируют явное перекрытие (Ashworth и Adams).

Разделение (формирование слоёв в пробирке) также зависит от нескольких факторов, включая время центрифугирования, скорость (обороты в минуту [rpm]) и g-силу (также называемую относительной центробежной силой [RCF]), как показано в следующей формуле: RCF = 11,18 × r × (N/1000)². В этом уравнении r — радиус в сантиметрах от центра ротора до образца во время центрифугирования, а N — скорость ротора в оборотах в минуту (rpm).

Очень важно понимать значение этих параметров. Например, это объясняет, почему не каждая центрифуга приводит к одинаковому разделению и, в случае лейкоцитарно- и тромбоцитарно-обогащённого фибрина (L-PRF), к формированию одинакового сгустка или мембраны L-PRF (Pinto и Quirynen, Miron и соавт.⁴).

Значение RCF немного варьирует внутри пробирки. На рисунке 3-2 показано, где в центрифуге с фиксированным углом достигаются минимальные и максимальные значения RCF.

Важное замечание

 Для оптимального получения мембран/сгустков L-PRF важно применять правильную g-силу (RCF). Последняя зависит от нескольких параметров и существенно различается между различными центрифугами. Рассчитать g-силу можно с помощью онлайн-приложения: найдите «RCF calculator». Необходимо выбрать радиус ротора в мм (средний радиус) и задать требуемое значение RCF (g-силы), чтобы получить правильную настройку скорости вращения (rpm).

Радиус ротора можно измерять в верхней, средней или нижней части пробирки, однако требуется значение радиуса в зоне формирования сгустка (примерно середина пробирки).

Стандартное центрифугирование для анализа крови

 При стандартном центрифугировании крови (например, при лабораторном анализе) используются пробирки с антикоагулянтами для предотвращения спонтанного свёртывания крови. Кроме того, по той же причине требуется инертная внутренняя поверхность пробирок. После этого процесса получают следующие компоненты (см. рис. 3-1d):
 Прозрачный слой плазмы крови в верхней части
 «Лейкоцитарная плёнка» (buffy coat) — тонкий слой лейкоцитов (WBCs), смешанных с тромбоцитами, в средней части
 Эритроциты (RBCs) в нижней части пробирки (клетки с наибольшей плотностью)

Таблица 3-1 Физические свойства клеток крови¹ 

	Эритроциты (RBCs)	Тромбоциты	Лейкоциты
Плотность (кг/м³ )	1095-1100	1040-1065	1055-1085
Площадь поверхности (мкм²)	140	28	330
Радиус (мкм)	4,0	11,5	5,0-7,5
Объем (мкм³ )	92	14	200

Адаптировано по Miron и соавт.¹ 

Рис. 3-2

Из-за угла наклона пробирки в роторе центрифуги g-сила (или RCF) различается между верхней (минимальной) и нижней (максимальной) частями. Наиболее важным является значение RCF в области формирования сгустка L-PRF, то есть в средней части пробирки. 

Таблица 3-2 Протокол получения оригинального L-PRF с последними модификациями 

Вариант PRF	RCFᵃ (g)	Время (мин)	Скорость (об/мин)	Публикация, впервые представившая концепцию
Сгустки/пробки/мембраны
L-PRF	408	12	2700ᵇ	Choukroun, 2001⁵
A-PRF	194	14	1500ᶜ	Ghanaati и соавт., 2014⁹
A-PRF+	145	8	1300ᶜ	Fujioka-Kobayashi и соавт., 2017¹⁰
Жидкие формыᵈ
Жидкий фибриноген	408	3	2700ᵇ	Cortellini и соавт., 2018¹¹
i-PRF	60	3	700ᶜ	Miron и соавт., 2017¹²
C-PRF	408	12	2700ᵇ	Miron и соавт., 2020¹

A-PRF — усовершенствованный тромбоцитарно-обогащённый фибрин; A-PRF+ — усовершенствованный тромбоцитарно-обогащённый фибрин плюс; i-PRF — инъекционный тромбоцитарно-обогащённый фибрин; C-PRF — концентрированный тромбоцитарно-обогащённый фибрин.
 ᵃ Измерено в области, где формируется сгусток L-PRF; для A-PRF часто указывается 276 g, однако это максимальная g-сила в пробирке, а не значение в области формирования сгустка.
 ᵇ Для центрифуги IntraSpin (Intra-Lock).
 ᶜ Для центрифуги Duo Quattro (Dr. Choukroun).
 ᵈ Эти варианты получают в пластиковых пробирках без стеклянного покрытия с целью замедления процесса коагуляции.

Важное замечание

 Для получения оптимального разделения при центрифугировании крови для подготовки L-PRF следует учитывать следующие рекомендации:
 Размещайте центрифугу на прочной и ровной поверхности.
 Из-за высоких скоростей вращения центрифуга должна находиться на устойчивой и ровной поверхности. Если вы замечаете, что центрифуга смещается или поверхность под ней прогибается, переместите её в более стабильное место.
 Размещайте пробирки напротив друг друга в центрифуге. Если вы центрифугируете только одну пробирку, необходимо подготовить балансировочную пробирку и разместить её строго напротив образца.
 Все пробирки должны иметь одинаковую массу. Обращайте внимание на метку на пробирке, указывающую точный уровень для правильного заполнения.
 Соблюдайте безопасную дистанцию во время работы центрифуги. Удары или перемещение центрифуги во время работы могут вызвать дисбаланс и привести к травмам. Крупные центрифуги вращаются с очень высокой скоростью и представляют серьёзную опасность при нарушении баланса.

Специфические протоколы для L-PRF и его модификаций

Подготовка оригинального L-PRF

Для получения L-PRF обязательны специальные пробирки (либо пластиковые с стеклянным покрытием, либо стеклянные), чтобы ускорить процесс коагуляции во время центрифугирования и сформировать сгусток L-PRF. Оригинальный протокол L-PRF (Choukroun, Dohan и соавт.⁶–⁸) предусматривает RCF 408 g (в области формирования сгустка) и время центрифугирования 12 минут (табл. 3-2). При использовании центрифуги IntraSpin необходимо установить скорость 2700 об/мин.

Модификации оригинального протокола

За последние 7 лет, несмотря на очень успешные результаты, полученные с использованием оригинальной концепции L-PRF в различных областях медицины (как в заживлении ран, так и в регенерации тканей), было предложено несколько новых протоколов центрифугирования (изменения RCF и времени вращения; см. табл. 3-2) с целью дальнейшего улучшения результатов.

 A-PRF и A-PRF+

Протоколы advanced PRF (A-PRF, Ghanaati и соавт.⁹) и advanced plus PRF (A-PRF+, Fujioka-Kobayashi и соавт.¹⁰) были разработаны с целью дальнейшего увеличения клеточного содержания в сгустке L-PRF и, соответственно, усиления высвобождения факторов роста. Предлагаются значения относительной центробежной силы 194 g для A-PRF и 145 g для A-PRF+ при времени центрифугирования 14 и 8 минут соответственно (см. табл. 3-2), причём, как и для оригинального L-PRF, необходимо использовать стеклянные или стеклянно-покрытые пробирки. Теоретически более короткое время центрифугирования и/или более низкая скорость вращения (rpm) уменьшают силы осаждения во время центрифугирования, что увеличивает общее количество клеток, удерживаемых в сгустке/мембране L-PRF.
На сегодняшний день получены противоречивые лабораторные данные относительно положительного эффекта этих модификаций центрифугирования с точки зрения клеточного состава и/или высвобождения факторов роста (Ghanaati и соавт.; Fujioka-Kobayashi и соавт.; Miron и соавт.; Castro и соавт., неопубликованные данные, 2021). Кроме того, клинические преимущества этих предположительно улучшенных сгустков/мембран ещё требуют подтверждения.

T-PRF

Tunalı и соавторы¹³ в 2014 году представили тромбоцитарно-обогащённый фибрин, полученный в титане (T-PRF). Протокол центрифугирования идентичен оригинальному протоколу L-PRF, с единственным отличием — использованием титановых пробирок для забора крови, исходя из гипотезы, что титан более эффективно активирует тромбоциты. Это должно приводить к формированию более прочной фибриновой сети. Клиническое превосходство и преимущества данного метода пока не подтверждены.

Важное замечание

Различия в высвобождении факторов роста между всеми этими модификациями концентратов тромбоцитов второго поколения незначительны и, вероятно, клинически несущественны. Подробности см. в главе 4.

Получение жидких форм PRF

В последнее время были также разработаны некоторые текучие формы (см. табл. 3-2). Они могут вводиться инъекционно (например, в суставы) или использоваться в сочетании с костнозамещающими материалами.

i-PRF

Инъекционный PRF (i-PRF) — это жидкая форма, также получаемая без добавок (без антикоагулянтов), но с использованием пластиковых гидрофобных пробирок для замедления спонтанного свёртывания крови. Кровь центрифугируют при 60 g всего 3 минуты. Верхний жидкий слой представляет собой i-PRF. Этот текучий PRF может использоваться как самостоятельно, так и в комбинации с различными биоматериалами (Miron и соавт.¹²). По сравнению с цельной кровью пациента, i-PRF содержит немного больше тромбоцитов и лейкоцитов (Varela и соавт.¹⁴). Благодаря своей текучей консистенции он может применяться для инъекций в болезненные суставы (Albilia и соавт.¹⁵), а также при некоторых дерматологических показаниях. Клинические преимущества i-PRF в оральной хирургии пока не подтверждены.

Жидкий фибриноген

Жидкий фибриноген также является текучей формой PRF (Cortellini и соавт.¹¹). Его значительное преимущество заключается в том, что он может быть получен при тех же настройках, что и L-PRF (то есть в рамках одной процедуры центрифугирования, без необходимости повторного центрифугирования или дополнительного забора крови).
Для получения жидкого фибриногена необходимо использовать пробирки с инертной внутренней поверхностью (для замедления каскада коагуляции), а время центрифугирования составляет всего 3 минуты при 2700 об/мин и относительной центробежной силе 408 g.
После этого следует собрать верхний жёлтый слой и использовать его в течение 30 минут, после чего он начнёт постепенно самопроизвольно свёртываться. Эта жидкость богата фибриногеном и впоследствии преобразуется в прочную трёхмерную фибриновую сеть (каскад коагуляции). Это свойство используется для фиксации биоматериала с целью формирования более прочного блока (sticky bone или костный блок L-PRF). Клиническая эффективность данного подхода недавно была продемонстрирована (Cortellini и соавт. и неопубликованные данные, 2021).

Таблица 3-3 Изменение скорости вращения (rpm) для получения требуемой RCF при использовании центрифуг IntraSpin или Duo Quattro для различных протоколов PRF 

Центрифуга и протокол	rpm	rcf
Центрифуга IntraSpinᵃ
Оригинальный протокол L-PRF	2700	408
Модификация A-PRF	1865	194
Модификация A-PRF+	1610	145
Модификация i-PRF	820	NA
Центрифуга Duo Quattroᵇ
A-PRF	1500	194
A-PRF+	1300	145
i-PRF	700	NA
Модификация L-PRF	2180	409
Протокол L-PRF без модификаций	2700	628

NA — не применимо

ᵃ Радиус ротора в области формирования сгустка = 50 мм

ᵇ Радиус ротора в области формирования сгустка = 77 мм 

C-PRF

 Miron и соавторы предложили новую методику получения, называемую концентрированным PRF (C-PRF), с целью выделения жидкой фракции PRF из специфического слоя «buffy coat» (0,3–0,5 мл непосредственно над слоем эритроцитов) сразу после центрифугирования крови. Этот участок действительно содержит высокие концентрации лейкоцитов и тромбоцитов (примерно в 20 раз выше, чем в крови). Этот текучий PRF может использоваться отдельно или в комбинации с биоматериалами. Клиническая значимость C-PRF ещё требует подтверждения.

Настройка параметров для различных центрифуг

 Как упоминалось выше, g-сила (RCF) может быть рассчитана по формуле: RF = 11,18 × r × (N/1000)². В этом уравнении два параметра являются ключевыми: r — радиус в сантиметрах от центра ротора до образца во время центрифугирования, и N — скорость ротора, то есть число оборотов в минуту (rpm). Однако значение g-силы или RCF существенно различается в разных частях пробирки, поскольку пробирки расположены под углом в центрифуге (см. рис. 3-2).

Оригинальный протокол L-PRF основан на RCF около 408 g в области формирования сгустка L-PRF. Для модификаций A-PRF и A-PRF+ значения RF составляют 194 и 145 соответственно. Если необходимо сохранить одинаковое значение RCF при переходе с одной центрифуги на другую, требуется корректировать скорость вращения (rpm) (табл. 3-3). Например, для получения L-PRF с использованием центрифуги Duo Quattro необходимо установить скорость 2180 об/мин. Если в этом устройстве выбрать стандартные 2700 об/мин, значение RF составит 628 g вместо требуемых 408 g. Для корректного сравнения результатов клиницисты, а особенно исследователи, должны учитывать этот фактор (Pinto и Quirynen³, Miron и соавт.⁴).

Стеклянные и пластиковые пробирки с силика-покрытием

Как упоминалось ранее, для получения мембран L-PRF (и их модификаций) крайне важно спонтанное свёртывание крови во время центрифугирования для формирования сгустка. Активация каскада коагуляции in vitro (в пробирке) происходит при контакте крови со стеклом (см. раздел «Свёртывание крови» в главе 2). Поэтому необходимо использовать либо стеклянные пробирки, либо пластиковые пробирки с внутренним силика-покрытием. Следует отметить, что последние часто предпочтительнее, так как снижают риск разрушения стекла.

Недавно Tsujino и соавторы¹⁶ исследовали качество двух пластиковых пробирок с силика-покрытием — Vacuette serum clot activator tubes (Greiner Bio-One) и Neotube celite tubes (NIPRO), а также одной пластиковой пробирки с силика-покрытой плёнкой (Venoject II, TERUMO) — продуктов, не одобренных регулирующими органами для получения L-PRF. Независимо от марки пробирки, авторы обнаружили значительные количества микрочастиц силики, включённых в сгусток L-PRF. Распространяется ли это также на пробирки с силика-покрытием системы Intra-Lock, остаётся сомнительным, поскольку эти пробирки получили одобрение FDA для использования при получении L-PRF. Кроме того, если

если частицы отделяются, они, вероятно, будут осаждаться во время центрифугирования и скапливаться на дне пробирки, учитывая, что их удельная плотность (2,15–2,30) значительно выше, чем у эритроцитов.
Сообщалось, что микрочастицы силики, в зависимости от их аморфности и размера, могут быть вредными при вдыхании (Brown¹⁷, Steenland Ward¹⁸). С другой стороны, следует учитывать, что аморфная силика фактически используется в различных продуктах, включая пищевые продукты, зубную пасту и даже костные заменители (Kobayashi и соавт.¹⁹).
Gürbüzer и коллеги²⁰ исследовали мембраны L-PRF, приготовленные в стеклянных пробирках, и выявили наличие кристаллоподобных частиц на внешней поверхности L-PRF. Они также поставили под сомнение, может ли это оказывать негативное воздействие.

Добавление антибиотиков к L-PRF

Контроль инфекции, безусловно, является необходимым условием успешного хирургического вмешательства. Доказательства относительно преимуществ применения системных антибиотиков до и/или после операции остаются ограниченными. Потенциальные побочные эффекты системных антибиотиков и возможность развития устойчивых бактерий делают их использование ещё более спорным (Lodi и соавт.²¹).

Локальное применение антибиотиков в области хирургического вмешательства может стать приемлемой альтернативой.

Показано, что мембраны L-PRF обладают антибактериальными, вероятно бактериостатическими, свойствами (Cieślik-Bielecka и соавт.²², Castro и соавт.²³, Polak и соавт.²⁴, Mamajiwala и соавт.²⁵). Эти данные согласуются с другими исследованиями, показывающими, что, например, плазма, обогащённая лейкоцитами и тромбоцитами (L-PRP), проявляет антимикробную активность в отношении Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis, Candida albicans и Streptococcus oralis (Bielecki и соавт.²⁶, Moojen и соавт.²⁷, Anitua и соавт.²⁸, Drago и соавт.²⁹, Cieślik-Bielecka и соавт.³⁰; обзор см. Varshney и соавт.³¹).

Однако так называемая естественная антибактериальная активность тромбоцитарных концентратов значительно ниже, чем эффект системных антибиотиков. Поэтому Polak и соавторы²⁴ исследовали возможность использования L-PRF в качестве локальной системы пролонгированного высвобождения антибиотиков. Они добавляли антибиотики в кровь непосредственно перед центрифугированием. Добавление антибиотиков в физиологическом растворе в объёмах 2 или 1 мл приводило к значительному ухудшению физических свойств мембран L-PRF, тогда как добавление раствора объёмом 0,5 мл — нет. Мембраны L-PRF с 0,5 мл антибиотика продемонстрировали значительное дополнительное антибактериальное действие.

Авторы данной книги исследовали, влияет ли добавление 0,5 мл метронидазола в кровь перед центрифугированием на длительное высвобождение факторов роста, и не обнаружили ингибирующего эффекта (неопубликованные данные, 2021). С другой стороны, добавление метронидазола явно усиливало его антибактериальное действие в отношении Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia и Fusobacterium nucleatum.

В том же исследовании также было изучено, улучшает ли предоперационная антибиотикопрофилактика антимикробную активность мембран L-PRF. Было выявлено значительное увеличение антибактериальной способности мембран L-PRF, приготовленных из крови через 2 часа после приёма 2 г амоксициллина (рис. 3-3). Это не следует рассматривать как основание для чрезмерного и необоснованного использования антибиотиков, а лишь как дополнительное преимущество у пациентов или в случаях лечения, требующих антибиотикопрофилактики или антибиотикотерапии.

Рис. 3-3 Антибактериальная способность мембран L-PRF до и через 2 часа после приема 2 г амоксициллина. Зоны ингибирования роста невелики без антибиотика, но значительно увеличиваются, особенно для Porphyromonas gingivalis (Pg), Prevotella intermedia (Pi) и Fusobacterium nucleatum (Fn), при использовании антибиотикопрофилактики. Aa, Aggregatibacter actinomycetemcomitans не был четко подавлен.